Considérations clés en matière de conception pour les protocoles d'étude de validation de la clairance virale des produits de thérapie génique

ICH Q5A(R2)-Fondation internationale pour l'harmonisation

L'ICH Q5A(R2) a été officiellement adopté le 1er novembre 2023 et représente le principal document d'orientation international pour l'évaluation de la sécurité virale. Par rapport au Q5A(R1) publié en 1999, les mises à jour importantes de la version R2 comprennent : un chapitre nouvellement ajouté sur l'évaluation de la sécurité virale dans la fabrication continue (chapitre 7) ; un rôle renforcé de l'évaluation des risques comme fondement des stratégies de clairance virale ; incorporation du séquençage de nouvelle-génération (NGS) dans les considérations de détection virale ; et des exigences explicites pour l'évaluation de nouveaux produits et procédés de fabrication. Q5A(R2) a été adopté par les autorités réglementaires, notamment la FDA, l'EMA et la PMDA, fournissant un cadre technique unifié pour la validation de la clairance virale dans le monde entier.

NMPA-Système de réglementation chinois

Le cadre réglementaire de la NMPA pour la sécurité virale couvre plusieurs niveaux :

Niveau de document	Nom du document	Année d'émission
Document fondateur	Directives techniques pour l'élimination/l'inactivation des virus présents dans les produits sanguins	2002
Document fondateur	Principes généraux pour l'examen technique de l'évaluation de la sécurité virale des produits dérivés de tissus biologiques-et des produits exprimés par des cellules eucaryotes-	2005
Consignes spécifiques au produit-	Lignes directrices techniques pour la recherche pharmaceutique et l'évaluation des demandes d'essais cliniques pour les produits de thérapie génique in vivo à base de vecteurs adéno-de virus associés (rAAV)-recombinants	2023
Consignes spécifiques au produit-	Exigences techniques communes pour la qualité pharmaceutique des produits de thérapie génique in vivo à base de vecteurs adéno-de virus associés au virus recombinant (rAAV)-pour les demandes d'autorisation de mise sur le marché	2025
Ligne directrice innovante	Lignes directrices techniques pour la validation de la plateforme des processus de clairance virale pour les applications d'essais cliniques de produits thérapeutiques à base de protéines recombinantes (essai)a	2024

a : Cette ligne directrice représente la première fois que l'autorité de réglementation chinoise définit des exigences techniques systématiques pour la validation des plates-formes des processus de clairance virale et est alignée sur l'esprit de l'ICH Q5A(R2).

FDA et EMA-Exigences réglementaires américaines et européennes

La FDA a officiellement publié un document d'orientation de l'industrie basé sur l'ICH Q5A(R2) en janvier 2024. En outre, le chapitre de la Pharmacopée américaine (USP)<1050.1>fournit des conseils techniques supplémentaires sur la conception, l’évaluation et la caractérisation des procédures de clairance virale. La FDA organise un Symposium sur la clairance virale tous les deux ans ; le symposium de 2023 a abordé des sujets de pointe tels que les nouvelles modalités, la fabrication continue, les nouveaux supports de chromatographie et les filtres adsorbants. Les principaux documents d'orientation de l'EMA incluent CPMP/BWP/268/95 (Note for Guidance on Virus Validation Studies: The Design, Contribution and Interpretation of Studies Validating the Inactivation and Removal of Viruses) et EMEA/CHMP/BWP/398498/2005 (Guideline on Virus Safety Evaluation of Biotechnological Investigational Medicinal Products), qui ont tous deux été harmonisés avec l'ICH Q5A(R2).

Identification des sources de contamination virale

L'ICH Q5A(R2) souligne que la conception de la validation de la clairance virale doit être basée sur une évaluation complète des risques. Pour les produits de thérapie génique, l’identification des sources de contamination virale doit porter sur les niveaux suivants :

Au niveau de la banque de cellules : virus endogènes (par exemple, particules rétrovirales) et virus infectieux latents potentiellement hébergés dans les substrats cellulaires de production (par exemple, HEK293, CHO, HeLa). Les cellules HEK293 sont connues pour contenir des séquences Ad5 E1 endogènes et un fragment EBV d'environ 900 pb, et sont capables d'exprimer un adénovirus compétent pour la réplication ; par conséquent, une attention particulière doit être accordée à ce risque dans l’évaluation des risques.

Niveau de virus auxiliaire : la production de vecteurs AAV utilise généralement des méthodes telles que la triple transfection utilisant des plasmides auxiliaires, qui comportent le risque de générer un adénovirus compétent pour la réplication (RCA). De même, les cellules d'empaquetage utilisées dans la production de vecteurs lentiviraux peuvent générer des lentivirus compétents pour la réplication (RCL).

Niveau des matières premières : des virus fortuits peuvent être introduits par les matières premières utilisées dans la fabrication, notamment les milieux de culture cellulaire, les aliments pour animaux et les enzymes. Ce risque est particulièrement important lorsque des composants d'origine animale-sont utilisés (par exemple, sérum fœtal bovin, solutions de digestion à la trypsine).

Différences de risque : thérapie génique par rapport aux protéines recombinantes traditionnelles

Dimension du risque	Produits de protéines recombinantes traditionnelles	Produits de thérapie génique
Source virale	Virus endogènes issus de banques de cellules ; virus fortuits	Virus des banques de cellules ; virus auxiliaires ; réplication-vecteurs compétents (RCV/RCL) ; intégration du génome hôte
Substrat cellulaire	CHO, NS0, Sp2/0 et autres lignées cellulaires bien-caractérisées	HEK293, HeLa, CHO, etc. ; certaines lignées cellulaires sont d'origine tumorigène
Caractéristiques du produit	Médicament à base de protéines- ; structure bien-définie	Vecteur viral ; présente des risques pour la biosécurité
Stratégie de validation	Clairance virale en plusieurs-étapes ; accent mis sur la validation des étapes du processus	Détection RCV/RCL requise ; la validation et les tests sont tous deux essentiels
Validation de la plateforme	Applicable aux procédés établis tels que S/D, faible pH, nanofiltration	Applicabilité limitée en raison de la diversité des types de vecteurs

Tableau 1. Comparaison des risques liés à la sécurité virale : produits de thérapie génique par rapport aux produits à base de protéines recombinantes traditionnelles

Principes généraux

La sélection des virus indicateurs est un élément central dans la conception des protocoles de validation de la clairance virale. L'ICH Q5A(R2) exige que la sélection des virus indicateurs soit basée sur l'évaluation des risques et tienne compte des facteurs suivants :

Pertinence du virus par rapport au substrat cellulaire de production (virus pertinent)

Propriétés physicochimiques du virus (enveloppé/non-enveloppé, ADN/ARN, plage de tailles)

Résistance du virus aux traitements physico-chimiques

Détectabilité et biosécurité du virus

Pour les produits de thérapie génique, la sélection du virus indicateur doit en outre prendre en compte : le rôle du virus vecteur lui-même en tant que « virus pertinent » ; le risque potentiel de contamination par le virus auxiliaire ; et les exigences de détection et de validation pour les virus-compétents pour la réplication (RCV/RCL).

Panneau de virus indicateur recommandé

Virus	Taper	Enveloppe	Génome	Taille (nm)	Justification de la sélection/candidature
MVM	Parvovirus	Aucun	ADNsb	18–26	Modèle non-enveloppé ; la plus petite taille et la plus haute résistance ; adapté à la validation de la nanofiltration (généralement non applicable aux produits vectoriels rAAV)
PPV	Parvovirus	Aucun	ADNsb	18–26	Modèle non-enveloppé ; virus indicateur couramment utilisé pour les produits sanguins
Réo-3	Réovirus	Aucun	ARNdb	60–80	Modèle non-enveloppé ; taille moyenne; grande stabilité physique
PRV	Herpèsviridés	Oui	ADNdb	150–200	Modèle enveloppé ; grande taille; large gamme d'hôtes
X-MuLV	Rétrovirus	Oui	ARNsb	80–110	Modèle de rétrovirus enveloppé ; approprié pour les substrats cellulaires dérivés de CHO-
BVDV	Flaviviridés	Oui	ARNsb	40–60	Modèle enveloppé ; utilisé pour évaluer les méthodes d’inactivation chimique (substitut du VHC)
VSV	Rhabdoviridés	Oui	ARNsb	70	Modèle enveloppé ; large tolérance au pH; adapté à la validation de l'inactivation à faible-pH

Tableau 2. Panel de virus indicateurs recommandé pour la validation de la clairance virale des produits de thérapie génique

Considérations particulières pour les produits vectoriels AAV

Pour les produits à vecteur AAV recombinant, les directives techniques de la NMPA pour la recherche pharmaceutique et l'évaluation des applications d'essais cliniques pour les produits de thérapie génique in vivo à base de vecteur rAAV-exigent qu'une attention particulière soit portée à la détection de l'AAV compétent pour la réplication (rcAAV). rcAAV fait référence à un AAV capable de réplication autonome, qui résulte généralement d'une recombinaison homologue entre le plasmide auxiliaire et le génome de l'AAV produit. La détection du rcAAV est généralement réalisée à l’aide de tests infectieux ou de méthodes qPCR, menés séparément sur la substance médicamenteuse et le produit purifié.

Il convient de noter que les processus de purification en aval des produits vectoriels AAV comprennent généralement la digestion des nucléases, la chromatographie (AEX), la nanofiltration et la chromatographie par échange d'ions (CEX/IEX). Dans la validation traditionnelle de la clairance virale, ces étapes du processus peuvent entraîner des pertes importantes du vecteur AAV lui-même ; par conséquent, l'interaction entre les virus vecteurs et indicateurs doit être soigneusement prise en compte lors de la conception du modèle à échelle réduite. Pour certaines étapes du processus (par exemple, la nanofiltration) où les pertes de vecteurs AAV sont substantielles, il convient d'évaluer si des ajustements du processus sont justifiés sur la base des données de validation (par exemple, l'ajustement de la taille des pores de la membrane de nanofiltration).

Principes généraux

Le-modèle réduit (SDM) est l'outil principal pour la validation de la clairance virale ; sa conception doit représenter avec précision les performances de clairance virale du processus de fabrication. L'ICH Q5A(R2), section 6.2.2, exige explicitement que le modèle réduit -maintienne la cohérence avec le processus de fabrication dans les paramètres clés. Pour les produits de thérapie génique, les considérations suivantes sont particulièrement importantes dans la conception SDM :

Représentativité des paramètres critiques du processus

Le modèle réduit-doit être cohérent avec le processus de fabrication dans les paramètres suivants : conditions chromatographiques (composition du tampon, pH, conductivité) ; rapport de chargement (rapport de masse de protéine vecteur/surnageant) ; temps et température de contact ; débit/temps de séjour ; pureté et composition du produit. Pour les produits AAV, l’effet de la distribution granulométrique vectorielle et de la teneur en capsides vides sur les performances de nanofiltration doit également être spécifiquement abordé.

Exigences de qualification du modèle

ICH Q5A(R2) exige une qualification adéquate du modèle de réduction-, y compris : la comparaison des attributs de qualité du produit (par exemple, pureté, récupération, densité) ; qualification de la cohérence des paramètres critiques du procédé ; et garantir que le modèle réduit-capte la variabilité du processus de fabrication. Pour les étapes de chromatographie, la cohérence du profil des pics, de l'élution et du lavage doit être qualifiée ; pour les étapes de nanofiltration, les effets de la capacité volumique et de la composition du produit doivent être vérifiés.

Formule de calcul du LRV

La valeur de réduction logarithmique (LRV) est la mesure de base pour mesurer l’efficacité de la clairance virale. La section 6.5 de l'ICH Q5A(R2) fournit une description détaillée des méthodes de calcul du LRV et du traitement statistique. La formule de base de calcul du LRV est la suivante : LRV=log₁₀(N₀/N), où N₀ est le titre viral initial après dopage viral et N est le titre viral résiduel après le traitement du procédé. Lorsque le titre résiduel du virus tombe en dessous de la limite de détection du test, des méthodes d'estimation telles que la distribution de Poisson doivent être utilisées (par exemple, tests en grand volume-).

Application des intervalles de confiance

Les normes ICH Q5A(R2) et EMA CPMP/BWP/268/95 nécessitent toutes deux une évaluation de l'intervalle de confiance des résultats du calcul du LRV. Un intervalle de confiance de 95 % est généralement appliqué.

Critères d'efficacité

Selon les directives techniques de la NMPA pour l'élimination/l'inactivation des virus provenant des produits sanguins, une réduction du virus supérieure ou égale à 4 journaux indique que l'étape du processus est efficace pour l'élimination/l'inactivation des virus. Cependant, ce critère ne constitue pas un seuil absolu et doit être évalué de manière holistique avec les courbes cinétiques d'inactivation, la justification scientifique de la sélection des virus indicateurs et la solidité globale de la conception du protocole de validation. Pour les produits de thérapie génique, une attention particulière doit être accordée à la capacité de clairance cumulée à travers toutes les étapes du processus afin de garantir que le profil global de sécurité virale se situe à un niveau acceptable.

Application et défis de la nanofiltration

La filtration rémanente des virus (nanofiltration) est une étape critique d'élimination des virus dans la purification en aval des produits de thérapie génique. Les filtres rémanents antivirus typiques ont une taille de pores d'environ 20 nm. Le mécanisme de clairance virale de la nanofiltration est principalement une exclusion basée sur la taille-, et il peut éliminer efficacement la plupart des virus plus grands que la taille des pores de la membrane, y compris les petits parvovirus non enveloppés tels que le MVM et le PPV.

Cependant, la nanofiltration pour les produits de thérapie génique est confrontée à des défis uniques : la taille des vecteurs AAV (environ 20 à 26 nm) est similaire à celle de certains virus indicateurs (par exemple, MVM, 18 à 26 nm), ce qui peut entraîner une récupération réduite du vecteur ; les capsides vides peuvent affecter le flux de filtration et l'efficacité de la rétention virale ; la viscosité de l'échantillon peut augmenter de manière significative avec la concentration du vecteur. Par conséquent, la conception SDM pour la validation de la nanofiltration doit pleinement tenir compte des effets de la distribution granulométrique du vecteur et du contenu des capsides vides sur les performances de filtration, et il convient d'envisager l'utilisation de membranes de nanofiltration avec des pores de plus grande taille, le cas échéant.

Évaluation de la clairance virale des étapes de chromatographie

La chromatographie échangeuse d'ions (IEX) est une étape essentielle dans les processus de purification des produits AAV, employant généralement une digestion par nucléase suivie d'une chromatographie échangeuse d'anions (AEX) pour capturer les capsides vides et défectueuses, ou d'une chromatographie échangeuse de cations (CEX) pour une purification fine des capsides pleines. Les mécanismes de clairance virale dans les étapes de chromatographie comprennent l’exclusion de taille, les interactions électrostatiques, les interactions d’affinité et d’autres facteurs. Les discussions lors du Symposium sur la clairance virale 2023 de la FDA ont souligné que l'efficacité de la clairance virale des étapes de chromatographie est influencée par de multiples facteurs, notamment la capacité de charge, le pH, la conductivité et le cycle de la résine ; une approche de conception orthogonale multi-facteurs doit être adoptée pour une évaluation complète.

Contrôle de la sécurité virale dans la fabrication continue

Le chapitre 7 nouvellement ajouté de l'ICH Q5A(R2) définit les exigences spécifiques pour l'évaluation de la sécurité virale dans la fabrication continue. Pour les produits de thérapie génique, la fabrication continue est devenue une direction de développement importante, mais elle introduit également de nouveaux défis en matière de sécurité virale. Les stratégies de contrôle de la sécurité virale dans la fabrication continue comprennent : -des filtres barrières antivirus en ligne comme mesures de confinement critiques ; conception appropriée des temps de séjour et des flux de processus ; incorporation d'étapes d'inactivation avec des temps de maintien définis ; et une application améliorée de la technologie d'analyse des processus (PAT) pour la surveillance en temps réel-des paramètres critiques du processus.